學(xué)術(shù)分享

從1987年首次發(fā)現(xiàn)CRISPR, 到最近幾年CRISPR-associated(Cas)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及2020年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了CRISPR的發(fā)現(xiàn)者，CRISPR技術(shù)被譽(yù)為會(huì)改變和造福人類的發(fā)明。短短幾年時(shí)間，CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門內(nèi)容，被稱為下一代分子診斷技術(shù)！

在專題講座《速度為先 | 新冠核酸快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及展望》中，胡必杰教授提出對(duì)于現(xiàn)在新型冠狀病毒，國(guó)家提到了快速檢測(cè)，上海市自10月28日起，全市首批21家二級(jí)以上綜合性醫(yī)療機(jī)構(gòu)面向市民提供24小時(shí)核酸檢測(cè)服務(wù)，爭(zhēng)取6小時(shí)出報(bào)告，對(duì)于現(xiàn)在新冠快速核酸檢測(cè)技術(shù)，與趙院士一起探討了值得期待和進(jìn)一步開發(fā)的技術(shù)和應(yīng)用。

趙國(guó)屏院士以新冠為例，講到對(duì)于一個(gè)“好的”臨床檢驗(yàn)產(chǎn)品，有5個(gè)關(guān)鍵要求：

第一，就是要正確，不能“錯(cuò)怪好人”，不能出現(xiàn)“假陽(yáng)性；必須準(zhǔn)確，不能“張冠李戴”，專一性、特異性要好。第二一定要靈敏，也就是說不能“放過壞人”，不能出現(xiàn)假陰性。第三最好能夠“定量”。定量是確定檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要佐證。第四，要快速，簡(jiǎn)便；第五成本要盡可能低。

胡必杰教授表示，趙院士提到的“不抓錯(cuò)好人”、“不放過壞人”，同時(shí)定量，讓臨床醫(yī)生更加精準(zhǔn)地去辨別是感染的病原體還是污染的病原體，同時(shí)簡(jiǎn)捷方便與價(jià)優(yōu)，是非常重要的。如果一項(xiàng)分子診斷技術(shù)非常昂貴，很多病人享受不到，只有達(dá)到以上五點(diǎn)要求，這項(xiàng)技術(shù)才能廣泛應(yīng)用到臨床，最終讓老百姓和普通病人得益。

等溫?cái)U(kuò)增與CRISPR診斷技術(shù)

的有機(jī)結(jié)合

而后趙院士提到，在過去幾十年的時(shí)間里，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了極大的發(fā)展，現(xiàn)有也已經(jīng)開發(fā)了很多種方法體系，包括經(jīng)典LAMP技術(shù)和RPA技術(shù)。等溫?cái)U(kuò)增有快速靈敏，對(duì)儀器要求低，是分子POCT診斷領(lǐng)域重要的技術(shù)力量。

第二項(xiàng)技術(shù)即是最近發(fā)展的CRISPR診斷技術(shù)。主流CRISPR診斷技術(shù)主要基于CRISPR-Cas12或Cas13來開發(fā)，利用了Cas蛋白“反式切割活性”，可以將體系中的單鏈核酸高效的切割。

所以，CRISPR診斷的原理就是：當(dāng)待檢體系中存在靶標(biāo)核酸時(shí)，Cas蛋白在向?qū)NA的引導(dǎo)下特異識(shí)別靶標(biāo)序列，形成復(fù)合物，進(jìn)而被激發(fā)出針對(duì)切割單鏈核酸的“反式切割活性“，將體系中的熒光標(biāo)記探針切碎，發(fā)出熒光信號(hào)，完成檢測(cè)過程，通過檢測(cè)體系是否發(fā)光來判斷靶標(biāo)核酸是否存在。

將恒溫?cái)U(kuò)增和CRISPR診斷技術(shù)結(jié)合起來，既可以利用恒溫?cái)U(kuò)增的快，靈敏和簡(jiǎn)便，又可以利用CRISPR的特異和靈敏，在進(jìn)行快檢的同時(shí)，既不用擔(dān)心檢測(cè)的假陽(yáng)性和假陰性問題，也不用擔(dān)心PCR檢測(cè)中不確定的“灰區(qū)”問題。

對(duì)于伯杰利用由其實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的，吐露港公司授權(quán)的CRISPR診斷專利技術(shù)，成功開發(fā)的國(guó)內(nèi)首款CRISPR快檢一體機(jī)BG-Nova-X8，院士對(duì)其速度和通量表示了贊賞，認(rèn)為儀器可以在30-40分鐘內(nèi)完成24個(gè)新冠標(biāo)本檢測(cè)，可以期待這個(gè)系統(tǒng)能夠?yàn)樾鹿诳鞕z多做貢獻(xiàn)。

趙院士提到，未來技術(shù)的展望，等溫?cái)U(kuò)增的特異性和靈敏度都需要進(jìn)一步提升，可以通過和別的技術(shù)結(jié)合，“取長(zhǎng)補(bǔ)短”來提升檢測(cè)特異性和靈敏度，這一次伯杰將等溫?cái)U(kuò)增與CRISPR技術(shù)的嘗試，就是邁出了可喜的一步。

等溫?cái)U(kuò)增的一管多重問題還需要?jiǎng)?chuàng)新的思路或者原理方面的突破，另一方面把恒溫?cái)U(kuò)增，CRISPR診斷技術(shù)，和數(shù)字PCR技術(shù)的絕對(duì)定量原理結(jié)合起來，來實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，在未來有更多發(fā)展的可能性。 

可以說，CRISPR/Cas系統(tǒng)毫無疑問為感染性疾病的診斷提供了新的方法和契機(jī)，總結(jié)來說，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：

這幾大優(yōu)點(diǎn)使得CRISPR檢測(cè)平臺(tái)可以對(duì)病原體核酸分子實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。根據(jù)以上的分析，未來CRISPR技術(shù)的兩大研究方向也初見雛形：

第一，是新的Cas蛋白的開發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅長(zhǎng)識(shí)別單鏈DNA，豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測(cè)通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。

第二，是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺(tái)結(jié)合起來，開發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管，以及將Cas系統(tǒng)的報(bào)告探針固定于電極上，從而實(shí)現(xiàn)不需要使用信號(hào)擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實(shí)現(xiàn)多樣化的信號(hào)輸出。與微流體技術(shù)結(jié)合開發(fā)出的CARMAN技術(shù)，可以對(duì)數(shù)十個(gè)樣本，上百種病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，為解決通量低的問題提供了方法等。

不斷地將新興的材料與技術(shù)與CRISPR技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，開發(fā)出更實(shí)用新穎的檢測(cè)策略用于感染性疾病診斷，將是未來一段時(shí)間內(nèi)的研究重點(diǎn)。