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學術分享

【干貨分享】第二期：顏色補償那些事兒

2022-01-20

多重熒光PCR已經廣泛地使用在各種病原體的檢測中，這得益于熒光PCR檢測儀多通道熒光采集的功能。在使用羅氏480（LC1/LC2/Z cobas)進行多重檢測時，往往會遇到需要做顏色補償的情況，那么今天小編就與您聊一聊關于顏色補償的那些事兒~

為什么羅氏480需要做顏色補償？

首先，我們來看一下羅氏480的激發(fā)波長及檢測波長

LightCycler1的濾光片:

圖片.png

LightCycler2的濾光片:

圖片.png

熒光通道發(fā)射光譜拋物線示意圖：

圖片.png

從上圖可以看出在一個多色反應中，由于各染料的發(fā)射光的波長有重疊，導致一個通道能夠捕獲到另一個通道所檢測的染料信號。這種熒光信號的溢出會導致無效的數據產生，即我們常說的“串色”或“串孔”現(xiàn)象。

由于每臺儀器的濾光片是固定的，無法改變其激發(fā)光與檢測光波長；想要校正這種溢出，在運行這個實驗或分析這個數據時，就需要應用顏色補償目標。當用顏色補償目標時，LightCycler 算法會使用補償實驗文件中的數據來補償熒光值的溢出，補償后即可以看到每個通道特定的信號。

什么時候要做顏色補償？

只有當多個熒光通道（比如VIC和ROX同時使用）用于數據分析時才有必要采用顏色補償，當使用單通道時無需采用顏色補償。

另外，由于合成的探針的熒光染料各個廠家之間存在一定的差異性，因此，不同廠家之間的顏色補償數據一般不通用。在更換檢測試劑盒時，需要進行對應廠家試劑的顏色補償實驗哦~

如何使用顏色補償？

首先，按顏色補償說明書進行顏色補償實驗

其次，進行常規(guī)的檢測實驗

最后，在每次檢測完畢的分析界面調用補償數據，具體操作如下：

A. 點擊Color Comp 旁下拉菜單

圖片.png

B. 選擇In Database

圖片.png

C. 選擇補償實驗數據

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D. 最后重新計算即可

E. 補償前后結果對比：

圖片.png

補償前

圖片.png

補償后

從補償前后結果來看，即可確定VIC通道中的翹尾，是ROX通道串孔所致。羅氏480分析界面調用補償文件的方法也是一鍵操作，十分簡便。針對一個廠家的試劑，顏色補償實驗只需做一次，數據便可一直使用。