學(xué)術(shù)分享

我們非常重視您的個(gè)人隱私，當(dāng)您訪問我們的網(wǎng)站時(shí)，請(qǐng)同意使用所有的cookie。如果您想詳細(xì)的了解我們?nèi)绾问褂胏ookie，請(qǐng)?jiān)L問我們的 隱私政策.

【干貨分享】第四期：PCR結(jié)果分析，自動(dòng)基線也別用啦

基線是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，即所謂的基線（如圖1）。

2022-02-21


上期干貨分享，淘氣的小編留了一手，其實(shí)調(diào)節(jié)閾值線在ABI7500上還有更快捷的方法，只要在曲線圖下方把“Auto”取消，再點(diǎn)擊勾選Show：Threshold就可以啦?。ㄈ缦聢D所示）

細(xì)心的你可能發(fā)現(xiàn)，除了Threshold（閾值線），還有Auto Baseline（自動(dòng)基線）。在通常情況下，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束，閾值線和基線都是默認(rèn)為“Auto”的，今天，我們就來聊一聊什么是基線？取消自動(dòng)基線，如何調(diào)節(jié)基線范圍？以及，基線調(diào)節(jié)和閾值線調(diào)節(jié)是怎樣配合分析PCR結(jié)果的？
　1. 什么是基線？　

基線是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，即所謂的基線（如圖1）。
基線范圍的設(shè)置是同步設(shè)置的，即不管一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)里面有多少擴(kuò)增曲線和通道，以及各曲線指數(shù)增長期的起始位置，以ABI7500為例，該儀器一般默認(rèn)的起始和終止循環(huán)數(shù)為3~15個(gè)循環(huán)（如圖2）。
圖 1

圖 2



2. 儀器自動(dòng)基線與手動(dòng)基線會(huì)呈現(xiàn)怎樣不同的結(jié)果？

情況一：你是否也遇到過這樣擴(kuò)增曲線，如圖3所示，機(jī)器自動(dòng)基線設(shè)置的太寬，就會(huì)導(dǎo)致基線下傾的現(xiàn)象。

圖 3

導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因就是機(jī)器自動(dòng)基線設(shè)置的太寬導(dǎo)致的，標(biāo)本在15個(gè)循環(huán)之前就進(jìn)入指數(shù)增長期，而機(jī)器自動(dòng)基線固定的把指數(shù)增長期作為基線，就導(dǎo)致此種曲線的出現(xiàn)，只需手動(dòng)把基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長期之前即可，比如將此數(shù)據(jù)的起止循環(huán)數(shù)調(diào)整為3-8個(gè)循環(huán)數(shù)后，擴(kuò)增曲線就恢復(fù)正常了，如圖4所示：

圖 4


情況二：基線不平，不僅可能存在的弱陽性曲線“被淹沒”，還導(dǎo)致閾值線“無從安放”，如圖5所示：

圖 5

此時(shí)，只需手動(dòng)把基線的起止循環(huán)數(shù)調(diào)整到合適位置即可，比如，把圖5的起止循環(huán)數(shù)改為10-20個(gè)循環(huán)后，基線就會(huì)變平整，閾值線也不再“無從安放”，如圖6所示：

圖 6


情況三：實(shí)驗(yàn)中常見的氣泡干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，如圖7所示：

圖 7

氣泡導(dǎo)致的折線，不僅影響閾值線調(diào)節(jié)的準(zhǔn)確性，更會(huì)影響結(jié)果的判讀。這種情況怎么調(diào)整基線呢？很簡(jiǎn)單，只需把基線的起始循環(huán)數(shù)設(shè)置在氣泡出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)后即可。比如，圖7中的2個(gè)孔位氣泡破裂的循環(huán)數(shù)為11、14，我們將起止循環(huán)數(shù)設(shè)置為15-20后，即可恢復(fù)正常，如圖8所示：

圖 8

此時(shí)調(diào)節(jié)閾值線，會(huì)更容易判斷閾值線應(yīng)該處于什么位置（可以參考上一篇干貨——調(diào)節(jié)閾值線），從而得到更準(zhǔn)確的Ct值。



3. 如何手動(dòng)調(diào)節(jié)基線？

文章開頭介紹了在ABI7500上調(diào)節(jié)手動(dòng)基線的快捷方法；而根據(jù)儀器的區(qū)別，調(diào)節(jié)基線的方式也會(huì)有所區(qū)別。一般來說，調(diào)節(jié)基線的位置都會(huì)在“Analysis”→ “Analysis Settings”這樣的菜單欄選項(xiàng)中，取消所有的“Auto…”，輸入合適的基線范圍，再“Apply”即可。不知道多少合適？沒關(guān)系，多調(diào)試幾個(gè)基線的范圍就可以調(diào)整出既美觀又準(zhǔn)確的基線了。


關(guān)于伯杰醫(yī)療

上海伯杰醫(yī)療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應(yīng)用，深耕于多重?zé)晒?PCR 診斷試劑和痕量病毒二代測(cè)序試劑及相關(guān)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線，從診斷試劑、診斷儀器、測(cè)序服務(wù)和醫(yī)檢所服務(wù)等多個(gè)面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng)新，質(zhì)量為先”的方針，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾控公衛(wèi)、高?？蒲械群献骰锇樘峁﹥?yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。

全國客服電話：400-860-3688